输入引物序列，算出长度、GC 含量与两种算法的 Tm，并检查 3′ 端 GC 夹、连续碱基、自身二聚体与发夹风险。
Wallace：Tm = 2(A+T) + 4(G+C)GC 法：Tm = 64.9 + 41(G+C−16.4)/NGC% = (G+C)/N × 100退火温度 ≈ Tm − 5 ℃只填 ACGT 碱基（自动转大写）；长度建议 18~25 nt。
| 指标 | 建议 |
|---|---|
| 长度 | 18~25 nt |
| GC 含量 | 40%~60% |
| Tm | 55~65 ℃，上下游相差 ≤5 ℃ |
| 3′ 端 | 避免连续 3 个 G/C，避免自身互补 |
Tm 是 50% 双链解链的温度。Wallace 规则只适合 14 nt 以下的短引物；长引物用 GC 法（Marmur 公式）更准。真实 Tm 还受盐浓度影响。
设计时上下游引物 Tm 尽量接近（差 ≤5 ℃），退火温度一般取 Tm 减 5 ℃，再根据实际扩增效果微调。
正常。短引物用 Wallace，长引物以 GC 法为准，二者本就适用不同长度范围。
常规 PCR 55~65 ℃。太高影响结合，太低易非特异。
高精度设计需要（如 SantaLucia 法），本工具提供常用近似值，足够常规实验。
不能完全替代。工具只做简单互补扫描，正式设计仍建议用 Primer3 等软件。